Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли­чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час­тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте­риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению. В РП используются жидкие прозрачные Аг.

Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг. Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль­но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот­кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля­ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг. Она нашла также применение в су­дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль­сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не­достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро­вании преципитата.

Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля. В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто­янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере­крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ. Широко используется для диагностики заболева­ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.

3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару­жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч­ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай­шим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабаты­вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро­цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу­говицы»

Преципитации реакция преципитации реакция

реакция взаимодействия in vitro антигена с антителом, приводящая к видимому невооруженным глазом помутнению среды или образованию осадка иммунного комплекса (преципитата). Применяется для идентификации антигенов и антител, контроля чистоты антигена, количественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Дляпостановки П. р. необходимы прозрачные растворы антигена и соответствующей сыворотки.

(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)

пробирочная реакция взаимодействия Ат с Аг в жидкой фазе или в геле, к-рая приводит к образованию видимых невооруженным глазом иммунных преципитатов (помутнения). Применяют для идентификации Аг и Ат, контроля чистоты Аг, количественного содержания Ат и Аг. Для постановки П. р. необходимы прозрачный р-р Аг, антисыворотка, физраствор или гель (1,5 - 2% агаровый и агарозный в вероналацетатном буфере, рН 6,8, ионная сила - 0,1). Чаще используют следующие методики: 1) реакцию колъцепреципитации. В преципитационную пробирку (пробирки) наливают по 0,2 мл преципитирующей с-ки с высоким титром и на нее осторожно наслаивают примерно такое же количество р-ра Аг (цельного или разведенного). В положительном случае через несколько минут на границе реагентов образуется подвижное кольцо белого цвета. Обязательны контроли Аг, с-ки, заведомо положительный, заведомо отрицательный и др. Применяют для идентификации Аг в экстрактах из различных материалов, в т.ч. инфекц.; 2) двойную радиальную иммунодиффузию по Оухтерлони. В равномерном слое 1% агарового геля толщиной около 1,5 мм пробивают лунки на расстоянии 4-10 мм и заполняют их р-рами антисыворотки и Аг. Результат учитывают через сутки (до 6 - 7 сут) инкубации при 4°, 20° и 37°С на влажном или высушенном и окрашенном препарате по числу и расположению линий преципитации. У однокомпонентных систем между лунками с Аг и Ат появляется одна линия, у многокомпонентных -несколько линий, при идентичных Аг линии сливаются, при неидентичных- пересекаются. Используют для качественного анализа, определения чистоты препаратов, идентификации Ат и Аг; 3) простую линейную иммунодиффузию по Удену. Применяют с теми же целями, что и двойную. Содержащий антисыворотку гель разливают по пробиркам или трубочкам. На гель в пробирках наливают р-р Аг, а трубочки помещают в стаканчик с р-ром Аг. Результаты учитывают после выдерживания системы при +4°С в течение 48 ч по наличию преципитата и фронта, к-рый прошел Аг. По формуле находят количество Аг; 4) простую радиальную иммунодиффузию по Манчини. Гель с моноспецифической с-кой ровным слоем наливают на стеклянную поверхность. После застывания в геле пробивают лунки и заливают в них р-ры иссл. Аг. Систему выдерживают 40 ч при +4° или 20°С. В положительных случаях вокруг лунки образуется преципитат, площадь к-рого отражает количество Аг. Аналогичным образом ставят контроль с серией разведении стандартного Аг. Измеряют диаметр зоны преципитата, высчитывают площадь и по калибровочной кривой находят количество Аг в 1 мл субстрата.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "преципитации реакция" в других словарях:

реакция преципитации - — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN precipitation reaction … Справочник технического переводчика

- (RW или ЭДС Экспресс Диагностика Сифилиса) устаревший метод диагностики сифилиса. В настоящее время заменён микрореакцией преципитации (антикардиолипиновый тест, MP, RPR Rapid Plasma Reagin). Названа по имени немецкого иммунолога Августа… … Википедия

реакция преципитации - rus реакция (ж) преципитации eng precipitin test, precipitation test fra réaction (f) de précipitation (f) deu Präzipitintest (m), Präzipitations Reaktion (f) spa reacción (f) de precipitación, reacción (f) de precipitinas, prueba (f) de… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Метод обнаружения и идентификации антител или растворимых антигенов, основанный на феномене преципитации … Большой медицинский словарь

Преципитация (лат. praecipitatio стремительное падение) В химии и биохимии синоним слова осаждение В иммунологии иммунологическая реакция осаждения из раствора нерастворимого комплекса антиген антитело, образующегося в результате соединения… … Википедия

Метод обнаружения малых концентраций антител, моновалентных гаптенов или поливалентных антигенов, основанный на торможении в их присутствии реакций преципитации, агглютинации или связывания комплемента вследствие специфического блокирования… … Большой медицинский словарь

Модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами антигена и антител … Большой медицинский словарь

Тест на наличие сифилиса, в котором определение характерных для этого заболевания антител в крови обследуемого производится с помощью реакции преципитации. Данный тест является менее доступным, чем некоторые другие.

Эта статья будет посвящена явлению реакции преципитации. Здесь мы рассмотрим особенности постановки данного явления, явление диффузии, общую характеристику, роль в жизни человека и многое другое.

Ознакомление с явлением

Преципитация - это явление серологического типа, в ходе которого происходит взаимодействие растворимых антигенов с антителами и вследствие этого наблюдается выпадение осадка - преципитата.
Общая характеристика реакции преципитации представляет собой форму согласованного влияния антигена и антитела. Такие типы взаимодействия позволяют определять наличие неизвестных антигенов в исследуемом веществе при помощи добавления известных антител и антигенов. Процесс преципитации без присутствия солей будет протекать хуже, а наилучший оптимум лежит в пределах диапазона от 7,0-7,4 pH.

Составные элементы реакции

Среди компонентов реакции преципитации выделяют три главных элемента:

1. Антиген, обладающий природой молекулярного характера. Он находится в состоянии мелкодисперсного типа, другими словами, он растворим. А также такой антиген называют преципитогеном, который является лизатом или экстрактом ткани и др. Преципитоген имеет характерное отличие от агглютиногена, которое заключено в размере частиц, из которых он состоит. Агглютиногену присущий размер клеток, а преципитогены соизмеряются с величиной молекулы. Раствор антигена характеризуется прозрачностью.
2. Антитело, находящееся в сыворотке человеческой крови, а также в иммунной диагностической сыворотке, которая содержит в себе изученные антитела.
3. Электролиты - это раствор хлорид натрия, которому свойственно изотоническое состояние.

Получение преципитогена

Постановка реакции преципитации невозможна без преципитогена, который получают при помощи измельчения материалов и извлекания из них антигенов белковой природы. Добывание происходит при помощи кипячения или других способов.
Ярким примером преципитогенов служат лизаты, а также тканевые и органные экстракты, сыворотки крови, разнообразные виды фильтратов, базирующихся на бульонных культурах из микробов, а также солевой экстракт микроорганизмов и аутолизатные вещества.

Постановка в преципитации

Теперь рассмотрим способ постановки реакции преципитации.
Производится кольцепреципитационная реакция, которая протекает в специально подготовленных пробирках. В полость посуды вносят сыворотку, разливая ее по стене при помощи носика пипетки. Далее, сверху аккуратно производят наслаивание соответствующего количества преципитогена, а потом пробирку приводят в вертикальное положение из горизонтального. Постановка и учет реакции преципитации - это весьма скрупулезные операции. Учет результата проводится после появления белого колечка на границе между антигеном и антителом. Если реагирующие элементы реакции соответствуют друг другу, то они связываются, но это становится заметным после продолжительного промежутка времени их взаимодействия.
Реакцию преципитации проводят также в чашке Петри или на предметном стекле, куда переносят агаровый гель, нанося его небольшим слоем. После его застывания в геле вырезают небольшое количество лунок, в которые будут помещены антигены и антитела. Существует два способа совершения подобного действия: метод радиальной иммунодиффузии и двойной иммунодиффузии.

Общие сведения

Механика работы преципитации схожа с устройством агглютинации. Подвергаясь влиянию сыворотки иммунного типа, антиген, уже вступивший в реагирование, уменьшает свою Важным условием является прозрачность как сыворотки, так и антигена.
Улучшить регистрацию реакции можно в том случае, если производить наслаивание антигенов на антитела. Вследствие этого можно наблюдать появление преципитатов в форме кольца. Это явление называется кольцепреципитацией и проводится в особых пробирках, имеющих диаметр от 2,5 до 3,5 мм. Одним из самых широко распространенных примеров реакции преципитации может служить диагностирование сибирской язвы.
Преципитация дает возможность определять уровень токсигенности дифтерийной культуры в агаре.
В ходе рассматриваемой реакции происходит осаждение антигенных комплексов и антител. Преципитация является иммунологическим феноменом, позволяющим определять количество содержания антител в сыворотках крови больного или вакцинированного человека и животных.

Следствие титрования

Важно знать, что данные, полученные путем титрования вышеупомянутого метода, не обладают количественным выражением. Чтобы создать и проанализировать количественную оценку содержащегося числа антител, была разработана М. Гейдельбергером и Е. Кабатом специальная методика реакции, в основе которой залегает поиск и выявление зоны эквивалентности. Смешивание возрастного числа антигенов с постоянной величиной объема антисыворотки приводит к возрастанию первоначально образующегося преципитата, а далее снова происходит его снижение вследствие увеличения способности к растворению комплексов антигена. Определив количество антител в надосадочных жидкостях, содержащихся в каждой пробирке, можно обнаружить, что в определенном числе посуды с антителами жидкость будет отсутствовать. Здесь будет образован, в сравнение с другими пробирками, самый большой преципитат. Благодаря этому и вычитанию из общей величины белков антигенного белкового преципитата, можно получить точную величину содержащихся антител в объеме конкретно исследуемой сыворотки. Далее, количество белковых молекул преципитата определяется по количеству азота или при помощи колориметрических методов.

Оценка значений

Оценка значений преципитации в диагностической методологии, должна учитывать вероятность наличия в иммунной сыворотке антитела, не обладающего свойством преципитина, из чего следует, что сам преципитат может не образоваться после реагирования с антигенами. В список таких молекул входят неполные антитела и некоторые виды из группы гамма-А-глобулинов.

Реакция преципитации в условиях лабораторий находит свое применение в разнообразных видах модификаций. Например, реакция термопреципитации применяется для выявления бактериальных антигенов ботулизма, сибирских язв и т. д., не подвергающихся денатурации термического типа. В отличие от кольцепреципитации, подобный тип реакции использует фильтраты рассматриваемого материала в прокипяченном состоянии.
преципитации в сложной смеси не позволяет давать характеристику свойствам отдельных элементов смеси. В таких случаях человек прибегает к методу преципитации в агаре, а также используют иммуноэлектроферез.

Преципитация диффузного характера

В данной области исследований существует понятие о реакции диффузной преципитации (РПД). Она основывается на способностях к диффузии в геле антител и растворяемых антигенов. Диффузия - это умение молекулы определенного вещества проникать в молекулы другого, что обуславливается тепловым движением.
Гель - это система дисперсного типа, в которой жидкостная фаза распределяется равномерным образом в твердой фазе. Чаще всего для такой реакции эксплуатируют гель агара.
После придания параметров, в условии которых молекулы смогут диффундировать по отношению друг к другу, их встреча будет сопровождаться образованием комплекса антигена + антитело. Такое новообразование способно диффундировать, находясь в самом геле, и оно будет выпадать в осадок, принимая вид полосы, которую можно обнаружить невооруженными глазами. В случае гомологичности антигена и антитела, полоса образовываться не будет.
Создание условий, в которых будет проходить диффузия, находясь в агаровом слое, предусматривает собой заливку компонентов, а вот общее число лунок и их взаиморасположение определяется типом задачи, которую необходимо решить. РПД дает человеку возможность обнаруживать и идентифицировать неизвестные выделенные вирусы при помощи исследования, с использованием заведомо известной сыворотки из антител.

Применение

Преципитация широко используется не только в диагностике заболеваний, но и находит свое применение в судебно-медицинской экспертизе. Сложно представить анализ, при котором можно определить видовую принадлежность крови, части органа или ткани, найденного на орудии преступления, в котором не используется реакция преципитации. В ходе данного процесса используют преципитирующие сыворотки, которые получают путем иммунизации различных животных и птиц. Важно, чтобы уровень титра в сыворотке был не меньше 1:10000, а также он должен обладать достаточной специфичностью. Из обнаруженного пятнышка крови или ее корочки изготавливают вытяжку на физ. растворе, которая в дальнейшем будет подвержена воздействию преципитирующей сыворотки. По данной реакции можно устанавливать виды тканевых и органных белков как человека, так и животного. Получение мутных вытяжек вынуждает прибегать к преципитации на агаре.

Выводы

Анализируя прочитанную информацию, можно заключить, что реакции преципитации крайне важны для человека, так как позволяют диагностировать различные антигены при помощи антител, также данное явление широко применяется в судебно-медицинской экспертизе и позволяет идентифицировать тип крови, ткани или органа по отношению к конкретному субъекту. Существует несколько видов и способов преципитации, которые используются в соответствии с возникающими потребностями решаемой задачи.

Реакции преципитации (от лат. precipitation - стремительное падение вниз) основаны на формировании и осаждении (выпадении в осадок) комплекса растворимый молекулярный антиген - антитело в присутствии электролита.

Максимум преципитации достигается при смешивании растворимых антигена и антитела в эквивалетных или близких к эквивалентым количествах. Для получения реакции преципитации антиген в возрастающих концентрациях добавляют к раствору антитела. Количество осаждающихся иммунных комплексов вначале возрастает, а затем падает. В кривой преципитации можно выделит три зоны:

• избытка Ат (количество добавляемого антигена недостаточно для того, чтобы связать все антитела);
• эквивалентности (когда все Ат и Аг связаны в комплексы);
• избытка антигена (количество антигена превышает необходимое для связывания всех антител).

Рис. 18. Кривая преципитации

Различают несколько разновидностей реакций преципитации.

Реакции кольцепреципитации . В узкую пробирку наливают иммунную сыворотку, содержащую антитела, затем сверху осторожно наслаивают раствор, содержащий растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Рис. 19. Реакция кольцепреципитации

Радиальная иммунодиффузия по Манчини - метод, позволяющий количественно определять антигены и антитела.

Антитела смешивают с агаровым гелем, затем полученную смесь наносят на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки, вносят в них раствор антигена в различных концентрациях и оставляют не менее чем на 24 ч. Антиген диффундирует в гель, связывается с антителами, и при достижении точки эквивалентности происходит осаждение комплексов антиген - антитело в виде кольца, диаметр которого прямо пропорционален концентрации антигена. Таким способом получают калибровочную кривую, с помощью которой можно количественно определить исследуемый антиген.

Кольцо преципитации

Рис. 20. Калибровочная кривая

Для количественного определения антител применяют этот же метод в обратной последовательности: в гель добавляют антиген, а в лунки - антитела.

Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации. Смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью элекрофореза, затем в канавку параллельно зонам элекрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии преципитации.

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Таблица 19. Схема реакции гемолиза

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.