Скл - смешанная культура лимфоцитов. Лимфоциты, субпопуляции

СКЛ - смешанная культура лимфоцитов
MLC - mixed lymphocyte culture

Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.

Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы. Систему лимфоцитов можно сравнить с государством, где есть начальники и подчиненные, а каждый служащий выполняет специализированную функцию.

Если лимфоцит встречает любые чужеродные для организма объекты (бактерии, вирусы, чужие клетки и т. д.), то развивается иммунный ответ. Если речь идет о чужих тканях или клетках, то степень иммунного ответа будет зависеть от похожести конфигурации антигенов тканевой совместимости (HLA, human leucocyte antigens, или MHC, major histocompatibility complex, (это синонимы) антигенов).

Иммунный ответ выражается в появлении клонов (потомков одной клетки) клеток, строго специализированных к конкретным чужеродным факторам). Другими словами, если иммунные клетки начинают реагировать на что-то, они начинают делиться. А деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК - тем сильнее делятся клетки, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Степень синтеза ДНК можно определить по включению в культуру клеток радиоактивного нуклеотида тимидина - "кирпичика" ДНК. На этом принципе основана оценка смешанной культуры лимфоцитов.

Технически это делается следующим образом. У супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты. Эти лимфоциты помещают в благоприятную для деления питательную среду. Если смешать лимфоциты разных людей, они начнут друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность смешанной культуры разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек, потому что "в бой" вступают клетки всех участников смешанной культуры.

Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию каждого участника культуры, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным деление клеток. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В такой культуре вся активность клеток будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и инактивированных клеток можно получить важную информацию о степени иммунологической похожести супругов.

Фактически в этом анализе, очень трудоемком, ставится 12 различных культур, а оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культуры.

Полученные 24 цифры позволяют получить важную информацию о том, как будет реагировать женщина на антигены тканевой совместимости мужа во время беременности.

Дело в том, что сохранение беременности - активный процесс. Так же, как при реакции отторжения, для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно адекватное иммунологическое распознавание пришельца. Если это распознавание вялое, или если оно происходит слишком поздно, зародыш атакуется естественными клетками киллерами матери и погибает.

СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа коррекции.

Поэтому при обнаружении "плохой" конфигурации цифр в СКЛ, часто приходится ее повторять уже после лечебных воздействий.

Вопрос:
Подскажите, пожалуйста, можно ли сдать кровь на СКЛ после (через 4-5 дней) прохождения пациенткой курса внутривенного вливания иммуноглобулинов (для супрессии ВПГ-2; 3 капельницы по 25 мл через день)? Не повлияют ли иммуноглобулины на достоверность анализа СКЛ?

Отвечает Кухорева Татьяна Александровна

Проведение курса терапии иммуноглобулинами может повлиять на результаты СКЛ. Поскольку иммуноглобулин воздействует на активность лимфоцитов, а в реакции СКЛ исследуется именно эта активность (в спонтанном состоянии, после смешивания с культурой лимфоцитов мужа, пула донорских клеток).
Желательно проводить исследование до использования иммуноглобулина либо через несколько недель (4-5) после терапии.
На результаты теста также могут влиять простудные заболевания, проведений вакцинаций, менструация.

Вопрос:
По результатам анализа интенсивность ответа в СКЛ снижена. В программе ЭКО на 14 ДПП ХГЧ был 11. Что делать?

Отвечает Айрапетов Давид Юрьевич
акушерско-гинекологическая клиника "Центр иммунологии и репродукции":
Дело в том, что ребенок является наполовину чужеродным для организма матери. Эта является нормальным физиологическим явлением, запускающим иммунологические реакции, направленные на сохранение беременности. Должны формироваться иммунные специальные защитные белки, которые оберегают плодное яйцо. Несовместимость супругов по HLA-антигенам и отличие зародыша от материнского организма является важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности. Сходство супругов по антигенам тканевой совместимости приводит к похожести зародыша на организм матери, что становится причиной недостаточной антигенной стимуляции иммунной системы женщины, и необходимые для сохранения беременности реакции не запускаются. Беременность воспринимается, как чужеродные клетки. В таком случае происходит самопроизвольное прерывание беременности. Для диагностики таких факторов невынашивания беременности проводится обследование на HLA-гены II класса (HLA-DRB1, DQA1 и DQB1-типирование), а также смешанная культура лимфоцитов. Слабое различие лимфоцитов супругов в СКЛ (смешанная культура лимфоцитов) и совпадение по HLA является показанием для проведения лимфоцитотерапии. Все это делается для того, чтобы повысить эффективность узнавания антигенов мужа в процессе формирования плаценты, что позволяет вовремя запустить механизмы сохранения беременности.

СКЛ - смешанная культура лимфоцитов - MLC - mixed lymphocyte culture. Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.

В ЦИР вы можете пройти обследование по СКЛ

Артикул	Наименование услуги	Стоимость
Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары
3736	Программа 1: Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары (первичная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога,СКЛ,повторная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога)	12 000 р.
3737	Программа 2: Оценка риска проблем фертильности по комплексному иммунологическому обследованию супружеской пары (СКЛ, повторная консультация акушера-гинеколога,гинеколога-эндокринолога)	11 000 р.

Использование СКЛ, которое было начато в нашем центре с весны 2000 г., позволило значительно улучшить качество лечение пациенток с бесплодием, невынашиванием беременности и неудачными попытками IVF.

2.2. Методы клеточных взаимодействий

В основе почти всех методов клеточных взаимодействий, используемых клинической иммуногенетикой, лежит феномен бластооб- разования в смешанной культуре лимфоцитов, открытый канадской исследовательницей Барбарой Бейн . Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte culture - MLC) позволила осуществить тонкое дифференцированное изучение комплекса HLA и, в частности, одной из его субъединиц - локуса HLA-D. Ряд других методов клеточных взаимодействий - клеточно-опосредованный лимфолизис (Cell-mediated Lympholysis - CML), тест примирования лимфоцитов (Primed Lymphocyte Typing) - основывается на методе MLC или содержит его как составную часть.

2.2.1. Смешанная культура лимфоцитов (MCL)

Принцип метода изображен на рис. 10, из которого видно, что две популяции различающихся генетически лимфоцитов взаимодействуют между собой в культуре in vitro. Одна из популяций обрабатывается митомицином С или облучается, в результате чего теряет способность к бластообразованию и включению тимидина (3 НТ), однако, не теряя антигенных свойств, сохраняет способность к стимуляции (стимуляторы; S-популяция).

Клетки, отвечающие на стимуляцию (респондеры, R-популяция), через несколько дней трансформируются в бласты и включают тимидин, добавляемый в культуру. Интенсивность реакции измеряется с помощью радиационной метки по включению 3 Н-тимидина.

Известны несколько вариантов реакции смешанной культуры лимфоцитов, из которых здесь предлагаются два: традиционный и микровариант, реализуемый в планшетах Cook (рис. 11).

Рис. 11. Оборудование для микровариантов MLC и CML. 1 - планшет круглодонный е 96 лунками; 2-автоматическая пипетка ("Pipetman") с программой для разных объемов; 3 - автоматическая пипетка ("Sigma") для определенного объема; 4 - наконечник для пипетки одноразового использования; 5 - ламинарный бокс

Традиционный вариант MLC (модификация Ф. С. Барановой):

Лимфоциты выделяют на фиколл-урографиновом градиенте, как описано выше. Первую отмывку производят в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); две последующие производят в среде 199 с 5%-АВ-сыворотки (пул от 15 доноров);

Отвечающие клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ и доводят концентрацию клеток до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

Выделенные таким же образом стимулирующие клетки в концентрации 5 - 10 6 в 1 мл обрабатывают митомицином С (60 γ/мл) фирмы "Serva" и инкубируют 40 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации клетки отмывают 3 раза средой 199 с 5% сывороткой АВ, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ, доводя концентрацию до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

0,5 мл отвечающих клеток и 0,5 мл стимулирующих клеток смешивают в центрифужной пробирке, прибавляют 0,04 мл 10 мл р-ра Hepes ("Serva") и инкубируют 144 ч; опыт ставят в трех параллелях (триплет);

За 24 ч до окончания инкубации в пробирки добавляют 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу удельной активности 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) и продолжают инкубацию;

По окончании инкубации клетки переносят на миллипоровые фильтры (0,6 - 0,9 микрон), промывают физиологическим раствором (37°С) и охлажденным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Фильтры сушат и помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкостью (5 г РРО и 0,5 г РОРОР - на 1 л толуола) * . Активность включения 3 Н-тимидина замеряют на β-счетчике; результат выражают в абсолютных включениях радиоактивной метки в 1 мин или в индексе стимуляции (ИС) по формуле:

* (РРО - 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензол). )

Среднее значение СРМ в трех опытных образцах

ИС = Среднее значение СРМ в трех контрольных образцах/Контрольными образцами служат спонтанные культуры отвечающих клеток.

Микровариант MLC в планшетах Cook . На 8-м Уоркшопе выработаны требования, стандартизирующие микровариант MLC, в соответствии с которыми он излагается ниже :

Лимфоциты выделяют в градиенте изопак-фиколла и ресуспендируют в среде RPMJ-1640 * , доводя концентрацию до 5х10 5 в 1 мл;

* (Можно использовать среду 199, смешанную с человеческой сывороткой группы АВ (5% сыворотки, взятой от нескольких индивидов). )

Клетки-стимуляторы обрабатывают митомицином С или обучением;

5x10 4 репондеров и столько же стимуляторов помещают с помощью микропипетки типа Pipetman в каждую лунку круглодонного микропланшета Cook;

Планшеты инкубируют в термостате с автоматической подачей 5% CO 2 в течение 120 ч; затем в каждую лунку вносят lμmCi 3 Н-тимидина при специфической активности тимидина 6 Ci/мМоль; все манипуляции проводят пипеткой Pipetman;

Через 16 ч после внесения тимидина культуры из каждой лунки автоматической пипеткой переносят на миллипоровые фильтры и промывают физиологическим раствором, а затем 5% трихлоруксусной кислотой; удобно использовать специальные "харвестеры" для переноса культуры на миллипоровые фильтры;

Активность включения тимидина определяют, как описано выше.

2.2.2. Клеточно-опосредованный лимфолизис (CML)

CML используется в иммуногенетических исследованиях сравнительно недавно (с 1972 г.), однако в последнее время становится все более популярной техникой, позволяя детально изучить роль эфферентного звена трансплантационного иммунитета и завоевывая признание как информативный метод иммунологического мониторинга. Принцип метода изображен на рис. 12. В основе метода лежит техника, предложенная J. Lightbody (1971), которая вкратце сводится к следующему.

1. CML начинается с обычного HLC-теста, в котором происходит распознавание отвечающими клетками "стимуляторов", сенсибилизация отвечающих клеток и формирование сенсибилизированных киллеров.

2. Вторая фаза, в которой сенсибилизированные киллеры смешиваются с меченными 51 Сr клетками-мишенями, состоит в деструкции последних эффекторными клетками-киллерами; клетки- мишени могут иметь генотип такой же, как "стимуляторы" в первой фазе MLC, а могут быть клетками "третьего" партнера", наделенными общими со "стимуляторами" антигенными детерминантами или без них.

3. Количество радиоактивного хрома, высвобождающегося из разрушенных клеток-мишеней и выходящего в культуральную среду, служит мерой интенсивности киллер-эффекта.

Рис. 12. Принцип клеточно-опосредованного лимфолизиса (CML). I ряд - сенсибилизация отвечающих клеток, образование киллеров; II ряд - взаимодействие киллеров с мишенью; III ряд - разрушение клетки-мишени; выход 51 Cr культуральную среду

Здесь описано три варианта CML: традиционный вариант в модификации Л. П. Алексеева (1979), микровариант в планшетах Cook, прямая CML (Direct-CML -D-CML.

Традиционный вариант [Алексеев Л. П., 1979].

Метод разделен на несколько этапов.

Получение киллеров :

Периферические лимфоциты обеих популяций (R-клетки и S-клетки) выделяют обычным путем, в градиенте плотности отмывают трижды в среде 199 с 5% АВ-сывороткой (10 мин, 150 g);

1x10 6 R-клеток (0,8 мл) смешивают в центрифужных пробирках с 2x10 6 S-клеток (0,2 мл), обработанных митомицином С, и инкубируют 144 ч при 37°С;

Клетки центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 20% телячьей сыворотки (среда 199 + т. е.), доведя концентрацию до 1x10 6 в 1 мл;

Одну из проб оставляют для исследования уровня MLC, остальные используют как готовые киллеры.

Получение мишеней :

Выделенные обычным путем лимфоциты ресуспендируют в среде 199 с 20% АВ-сывороткой и инкубируют с фитогемагглютинином (0,003 мг/мл Wellcome) в течение 72 ч при 37°С; концентрация клеток 1x10 6 в 1 мл;

Клетки центрифугируют 10 мин при 150 g, осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой и доводят концентрацию клеток до 2x10 4 в 1 мл;

К взвеси добавляют 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) и инкубируют 40 мин при 37°С;

Клетки трижды отмывают в среде 199 с добавкой 5% АВ-сыворотки (150 g, 10 мин) и осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой,. доведя концентрацию до 2x10 4 в 1 мл.

Постановка реакций :

5x10 5 киллеров (0,5 мл) смешивают с 1x10 4 мишеней (0,5 мл), инкубируют 4 ч (37°С) и центрифугируют при 150 g 10 мин;

Суспернатант отсасывают и на?-счетчике подсчитывают импульсацию, вызываемую 51 Cr; подсчет ведут в 0,5 мл супернатанта;

Уровень цитолиза подсчитывают по следующей формуле:

экепер. выход 51 Cr - спонтанный выход 51 Cr/максим, выход 51 Cr - спонтанный выход 41 Cr × 100.

Спонтанный выход хрома измеряется на мишенях, инкубированных 4 ч (37°С) без клеток-киллеров; максимальный выход хрома - на мишенях, полностью разрушенных замораживанием-оттаиванием; все пробы осуществляются в триплетах.

Микровариант CML в планшетах [по Mawas С., 1976]:

Фаза получения киллеров осуществляется как MLC в круглодонных планшетах, но смешивают в равных количествах R- и S-клетки по 2x10 5 па каждую лунку и инкубируют при 37°С;

Через 5 сут клетки собирают пастеровской пипеткой в пробирку, подсчитывают с трипаном голубым число живых и доводят концентрацию до 10x10 6 в 1 мл;

Клетки-мишени в течение 3 дней культивируют с ФГА;

В день постановки реакции клетки-мишени отмывают (300 g) и ресуспендируют в культуральной среде, распределяя по 1 мл в пробирки и доводя до 1x10 6 в 1 мл;

Добавляют в каждую пробирку с клетками-мишенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) и инкубируют 1 ч при 37°С; отмывают клетки 3 раза; осадок ресуспендируют и доводят до концентрации 1x10 в 1 мл (живых);

Тест реализуется в круглодонных микропланшетах; для этого распределяют в каждую лунку 0,7 - 1x10 6 клеток-киллеров (0,1 мл) и 1x10 4 клеток-мишеней (0,1 мл); общий объем суспензии в каждой лунке 0,2 мл, добавляют в каждую лунку по 0,05 мл среды и инкубируют (37°С) 4 ч;

Планшеты центрифугируют при 800 g на центрифуге Beckman в течение 10 мин; супернатант из каждой лунки переносят в пробирки и подсчитывают на γ-счетчике;

Фазу получения киллеров (MLC) проводят на среде RPMJ-1640 с добавлением 20% человеческой плазмы; для фазы киллинга употребляют среду MEM с добавлением 20% человеческой плазмы, предварительно прогретой.

Прямая CML (D-CML). Прямая CML является техникой, созданной специально для клинических целей, нашедшей использование при иммунологическом мониторинге. Схема этой реакции изображена на рис. 13.

Основное отличие от традиционной CML состоит в том, что стадия образования киллеров (фаза сенсибилизации) протекает не in vitro, a in vivo, т. е. в организме человека, сенсибилизированного пересадкой аллогенного органа или ткани. Вследствие воздействия аллогенной ткани лимфоциты реципиента сенсибилизированы к тканевым антигенам донора и не нуждаются в специальной обработке in vitro, продолжительность теста значительно сокращается во времени, так как предварительно следует подготовить только мишени.

В качестве мишеней используют лимфоциты, полученные из периферической крови или, чаще, из селезенки донора (см. 2.1.2) и замороженные любым из описанных выше способов (см. 2.1.3).

2.2.3. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (Antibody-dependent-cell mediated Cytotoxicity - ADCC)

Этот тип клеточных реакций сходен по механизмам действия с описанной выше CML. Принцип реакции изображен на рис. 14. Компонентами реакции являются клетки-мишени (донорские клетки или аллогенные лимфоциты), сыворотка (аллогенная или реципиента), предположительно содержащая антитела, направленные к детерминантам клеток-мишеней, и клетки-эффекторы (лимфоциты реципиента или аллогенные лимфоциты).

Клетками-эффекторами в данном типе взаимодействия служат так называемые К-клетки, находящиеся в периферической крови. В отличие от клеток-киллеров в CML они осуществляют цитотоксический эффект без предварительной сенсибилизации, однако проявление цитотоксического действия К-клеток возможно только через посредство антител, направленных к детерминантам клеток-мишеней . Специфический лизис измеряется по высвобождению 51 Cr, если исследуемая сыворотка содержит антитела к детерминантам мишеней.

Детерминантами-мишенями в ADCC могут быть практически специфичности всех HLA-локусов, включая HLA-D, HLA-DR, а также детерминанты, лежащие вне HLA-системы .

Наибольшее распространение эта сложная реакция получила в иммунологическом мониторинге для выявления В-клеточных антител. В связи с этим было предложено несколько модификаций, предусматривающих обогащение суспензии клеток-мишеней В-лимфоцитами, адсорбцию сывороток на тромбоцитах и т. д.

Помимо всего, учитывается ряд других особенностей реагирования в данной системе. Исследуемая сыворотка должна быть декомплементирована, так как в противном случае реакция может пойти по типу антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичности. Предполагается также, что клетки-эффекторы могут вызвать определенную деструкцию мишеней по типу CML.

В конечном итоге весь набор проб в тесте антителозависимок клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности следующий:

Мишени + эффекторы + испытуемая сыворотка (опытная проба);

Мишени (контрольная проба, т. е. спонтанное высвобождение 51 Cr);

Мишени + эффекторы (контрольная проба на активность эффекторов);

Мишени + испытуемая сыворотка (сывороточный контроль).

Лимфоциты выделяют обычным образом и ресуспендируют в RPMI-1640 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки; обрабатывают суспензию карбонильным железом для удаления моноцитов; добавляют аммония хлорид или H 2 O для лизиса оставшихся эритроцитов;

В суспензию клеток-мишеней добавляют 51 Cr в форме р-ра Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) и инкубируют 40 - 60 мин;

Клетки трижды отмывают в RPMI +0,1% HSA, ресуспендируют в той же среде и доводят до 2x10 8 в 1 мл; 50 µl суспензии меченых клеток помещают в пробирку и в дальнейшем подсчитывают изотопную активность на γ-счетчике для выявления полного изотопного "усвоения"; остальное раскапывают в лунки планшета по 50 µl суспензии (1x10 5 клеток на лунку);

Суспензия клеток-эффекторов доводится до 2x10 7 кл в 1 мл и в. каждую лунку помещают 50 µl суспензии (или 100 µl), соотношение эффекторов и мишеней 10:1 (или 20:1);

Инкубация продолжается 4 ч во влажной атмосфере термостата с 5% CO 2 (длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч);

Приготовляют в пробирках несколько разведений испытуемой сыворотки (1:25; 1:100) и добавляют в лунки до 50 µl каждого разведения: и неразведенную сыворотку; окончательная постановка теста выглядит, как показано в табл. 23.

Таблица 23

Постановка ADCC. Все варианты проб, µl

* (Вместо испытуемой сыворотки закапывают пул АВ-сывороток. )

** (Вместо испытуемой сыворотки закапывают моноспецифическую HLA-сыворотку, направленную против мишеней (не эффекторов). )

Инкубация панелей продолжается 4 ч во влажной атмосфере с 4% CO 2 ; длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч;

После инкубации половину объема из каждой лунки (100 μl) осторожно отсасывают автоматической пипеткой и помещают в пробирки для подсчета импульсации 51 Cr; активность подсчитывают на γ-счетчике;

Вычисления следующие:

% высвобождения 51 Cr = 2 × А оп - фоновая активность/В - фоновая активность × 100;

% цитотоксичности = А оп - А сп /100 - А сп × 100, где А оп - % высвобождения 51 Cr в опытных пробах; А сп - % спонтанного высвобождения; В - полное усвоение изотопа.

Как положительный результат рассматривается 5% и выше цитотоксичность после 4 ч инкубации.

Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродными MHC-II детерминантами, расположенными на В-лимфоцитах, макрофагах. Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. Для оценки реактивности индивидуума в отношении аллельного варианта МНС готовят однонаправленную культуру лимфоцитов. Для этого клетки-стимуляторы предварительно обрабатывают митомицином или облучают, при этом стимулирующие клетки теряют способность к делению, но сохраняют жизнеспособность.

Реактивность в смешанной культуре лимфоцитов является од-ним из критериев в оценке клеточного иммунитета. СКЛ позволяет провести типирование HLA, подобрать пару донор-реципиент при трансплантациях тканей и органов, провести корреляцию между HLA-антигенами и определенными заболеваниями.

Для постановки реакции используют взвесь лимфоцитов, выделенных из крови пациентов (донора и реципиента). Отмытые отвечающие клетки суспендируют в небольшом количестве среды 199 (0,5 мл) и после подсчета количества клеток доводят до 0,6 * 10 6 клеток/мл. Суспензию стимулирующих клеток приготовят аналогично с добавлением раствор митомицина С (500 мкг митомицина С в 1 мл забуференного физраствора) из расчета 0,1 мл на 1 мл суспензии. Клеточную смесь инкубируют 40 минут при 37 °С на водяной бане, помешивая, затем к суспензии добавляют холодную среду 199 и трижды отмывают клетки при центрифунировании. Осадок суспендируют в питательной среде культивирования, доводя количество клеток до 0,6 * 10 6 клеток/мл.

В лунки стерильного круглодонного иммунологического планшета внесят по 0,1 мл клеточной суспензии в растворе Хенкса и добавляют 0,1 мл клеточной суспензии, несущей аллельные варианты МНС. В контроль добавляют такое же количество раствора Хенкса.

Учет результатов проводят после инкубировать клеток при 37 °С 3-5 суток в зависимости от постановки реакции с использованием морфологического или изотопного метода (см. РБТЛ).

При трансплантации костного мозга выбор гистосовместимого донора проводится по результатам HLA-типирования донора и реципиента, а также при определении совместимости отобранных HLA-идентичных пар донор-реципиент в СКЛ, которая является финальным этапом оценки совместимости. Для этого используется постановка двунаправленной реакции СКЛ с использованием культурального микрометода в 96-луночной планшете с оценкой величины пролиферации по включению радиоактивного Н 3 -тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов.

Возрастные ограничения к каждому тесту (есть ли референсные значения для детей или лиц старше определенного возраста – например: для теста 191 отсутствуют референсные значения для людей старше 80 лет).

При выдаче ответа на бланке бывают приведены референсные значения, соответствующие указанному полу и возрасту пациента.

В ИНВИТРО для некоторых тестов есть возрастные ограничения (поскольку референсные значения для определенного возраста отсутствуют), в медицинском офисе должны об этом предупредить. Ограничения чаще затрагивают детей младшего возраста. Надежные исследования по выработке референсных значений для детей этого возраста могут отсутствовать, а многие показатели в этом возрасте сильно отличаются от значений, ожидаемых у взрослых (дети – это не маленькие взрослые).

Что касается лиц старше 80 лет – если нет установленных референсных значений конкретно для этой группы, им, с определенной осторожностью, можно использовать референсные значения, полученные для наиболее близкой возрастной группы других взрослых.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Почему при гемолизе некоторые тесты были выполнены? Почему не все тесты выполнены при гемолизе образца?

Гемолиз неодинаково влияет на разные тесты, поэтому результаты анализов, которые могут быть искажены гемолизом – не выдаются. Напротив, если влияние его на тест незначительно или отсутствует – результаты выдаются пациенту.

Гемолиз – это разрушение клеток крови с высвобождением их содержимого во внеклеточную жидкость (например, в сыворотку, плазму). Виной этому могут быть как процессы, происходящие в организме пациента, так и нарушение технологии взятия, транспортировки и обработки пробирок с кровью.

Высвободившиеся из разрушенных клеток вещества могут значительно изменить результаты некоторых тестов как за счет прямого воздействия на этапы анализа, так и за счет увеличения количественного содержания определяемого вещества. Влияние гемолиза на результаты анализа различно в зависимости от теста, прибора, методики выполнения и интенсивности самого гемолиза.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Почему результаты разных лабораторий не совпадают?

Результаты одних и тех же тестов, выполненных в разных лабораториях в большинстве случаев, отличаются. Причина этого - индивидуальные особенности пациента, разные условия взятия биоматериала, методы выполнения теста и выдачи результата.
Первый фактор, который оказывает влияние на результаты – погрешность измерения. Это неизбежное закономерное отклонение результата исследования от идеальных показателей на всех этапах.

Биологическая - это естественные колебания количества тестируемого вещества в зависимости от индивидуальных особенностей организма пациента, факторов среды, терапевтических факторов и условий взятия биоматериала. Учитывая разницу во времени между двумя процедурами взятия биоматериала, а также то, что происходило в это время, могли измениться условия подготовки к анализу, само физическое состояние пациента, содержание некоторых веществ подвержено суточным ритмам, особенно подвержены изменению вещества в случае, если в это время шёл терапевтический процесс.

Аналитическая – колебания измеряемых показателей согласно законам физики и химии, которым подчиняются оборудование и реагенты. Учитывая особенности лабораторного процесса даже исследуя одномоментно две пробы одного и того же образца, мы не получим абсолютно одинаковых значений измерения.

Второй фактор, само лабораторное исследование – это сложный многоэтапный процесс, каждый этап которого состоит из 5-ти изменяющихся во времени и от лаборатории к лаборатории элементов:

Биоматериал, его свойства, условия доставки, хранения и обработки.
Персонал, его квалификация и действия.
Приборы, анализаторы, реагенты.
Методы организации работы.
Система контроля качества.

Сочетание всех этих составляющих отличается в разных лабораториях, и не может приводить к получению абсолютно «одинаковых» результатов.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Насколько достоверны результаты исследований?

Результаты анализов, проводимых Инвитро, отвечают международным стандартам качества и признаны достоверными.

Достоверность результатов анализов – термин, характеризующий насколько полученный результат близок к истинному содержанию вещества в исследуемом биоматериале. Достоверность результатов анализов является частью понятия качества и складывается из многих составляющих.
Наибольший вклад в достоверность результата вносит подготовка к исследованию, а также правильность манипуляций с образцом крови, на этом этапе может происходить до 62% всех ошибок. Подтверждение, доставка и трактовка результата лечащим врачом может быть источником 23% ошибок.

Современная лаборатория может послужить причиной не более 15% всего количества возможных погрешностей, и эта цифра зависит от слаженности работы лаборатории, ее оснащения и установленных критериев качества.

Инвитро является крупнейшей в России частной медицинской компанией, и забота о качестве занимает в ней исключительно важное место. В Инвитро под контролем все этапы анализа - от взятия биоматериала до выдачи результата: работа медицинских офисов, курьерской службы, лаборатории – всё подчиняется единым правилам, т.н. стандартным операционным процедурам, где каждый шаг описан в мельчайших подробностях с целью исключить возможные ошибки.

Помимо многоуровневого внутреннего контроля качества, лаборатория Инвитро принимает активное участие в нескольких системах внешней оценки качества, сравнивая свои показатели с результатами других лабораторий. В 2016 году Инвитро подтвердила качество лабораторных услуг на международном уровне – в программе «Шесть сигм» компании «Westgard QC». Согласно заключению программы, количество возможных погрешностей в работе лаборатории не больше 3,4 на 1 000 000 случаев.

Признанием важности всей этой кропотливой работы в нашей стране стало вручение Премии Правительства РФ в области качества в ноябре 2017 г.